Orbit mini客户使用报告

作者: Lance  日期:2017-09-18 13:10:04


作者:Chris Miller, 布兰迪斯大学教授


我之前40年都是用自制的平板脂双层记录膜碎片或提纯蛋白样品中的离子通道,直到最近购买了一台Orbit mini系统。

之前我很怀疑Nanion公司宣传的该设备可以改善噪音水平,但是我还是被其低噪音水平以及其简洁与便携打动而购买了该设备。此外,随着更多实验室着手通过平板脂双层研究提纯的离子通道功能,该设备提供的标准化配置能降低新用户使用该技术的门槛,因为自制平板脂双层系统不是一件容易的事情。 我写这篇文章的目的是比较我长期使用的自制平板脂双层设备与 我们刚开始使用2-3个月的Orbit mini在我们现在研究方面的应用 : ~10 pS 氟选择性离子通道在10-ms级时间幅度内表现出罕见的关闭事件。这个实验所有的工作都是Nick博士做的,Nick博士是我们的博士后,而且之前并没做过电生理相关工作。 Nick博士的经验可以展示了一个生化学家第一次做平板脂双层通道记录的情况。

 


我们比较了Orbit mini与我们目前的平板脂双层系统,我们的系统一直在使用并持续优化了数十年,这套系统包含一个有水平分隔的塑料小盒,分隔中间有一个直径~50 µm的可以将脂双层涂抹在上面的小孔,这个小孔将0.7 mL的 "上室"和0.2 mL 的"下室" 两个小室联通。 分隔是用透明胶片 (80 µm 厚)剪切制成的, 使用后清洗并保存在乙醇中,理论上可以重复使用数年。小盒通过盐桥与标准膜片钳记录设备(Axopatch 200-series or Warner 505)连接。小盒与探头安装在一个带盖的金属盒子里,周围包上隔音材料,并放置在一个防震台上,脂双层在体视显微镜下"涂抹" 在小孔上,为了实现高质量记录, 我们选取并使用 30-40 pF 电容的脂双层。为了能在100 mV钳制电位下记录1-pA F-通道,我们将低通滤波器的转角频率设为200 Hz,这样可以很容易识别~1-10-ms的关闭事件 (rms noise ~ 0.3 pA),此外,探头电压噪音会通过膜电容被放大,这是脂双层实验主要的噪音源之一,这个噪音每片膜、每一天的实验都不一样,这中噪音是室内声音的拾音放大,因为它包含低频部分所以通常很难被滤掉。


与我想象的相反, Orbit mini (下图红箭头)在我们的实验中表现的很好,极大的提高了信噪比,比我们自制的仪器最好的记录还要好。电子噪音水平的改善有一部分得益于设备的小型化,但是我认为主要是因为制备的脂双层更小(~10 pF),因为是在芯片小室 (MECA芯片,由Ionera Technologies公司开发)内制备的。这导致更小的电容与拾音放大效应,结果很有意思。在Orbit mini上记录1 pA 的通道,我们可以将滤波频率设到625 Hz以实现 ~0.2 pA rms 噪音水平,这表示信号相对于噪音要好三倍以上,这是一个很大的优势了。我很好奇为什么这么小的脂双层依然可以轻易的插上离子通道,在我们自制系统中,小于 ~25 pF 的膜就极难以插入蛋白了,我怀疑MECA芯片中形成的孔独特几何形状让小膜片也能轻易插上蛋白。



Orbit mini小巧的造型可以非常灵活与方便的安置在实验室内,因占地面积很小,所以可以放在任何桌面上并配备上一台电脑就可以工作了,另外脂双层也可以不需要显微镜下观察直接使用Nanion公司提供的工具涂抹。 所以整个支持设备,包括显微镜、冷光源、法拉第笼、防震台和各种支架都不需要,记录软件很直观与稳健,而且数据可以直接保存为Axon分析程序可以读取的格式。此外,芯片上有四个独立的孔室,可以同时记录四个脂双层实验,这样可以将捕获并形成单通道记录的概率提高四倍,这能极大的提高实验的效率


我们使用Orbit mini这个新设备全过程中的学习曲线很平滑, 不过我们也遇到了一些问题,而Nanion公司技术支持人员也很快给予了有帮助的回复。


1. 芯片钝化:Nanion声称每个芯片可以清洗并重新使用3-5天而不钝化。但是我们最初的几个星期,新的MECA芯片只能在打开第一天形成稳定的脂双层。我们最终通过在我们所有的溶液里加入50µg/mL 血清蛋白(抑制加入的蛋白粘结在小室壁上)。我们没法将这些残留清洗掉,但是如果省略这个成分,芯片的寿命就与宣传的一致了。
2. 制备脂双层所需的磷脂溶液: 我们一直使用10 mg/mL 溶解在n-癸烷中的磷脂来制备脂双层。但是这在MECA芯片上效果不是很好,我们发现使用n-壬烷作为磷脂溶剂在该系统上特别好用---甚至比推荐的n-辛烷更好。自制系统上必需的用风干的磷脂预处理小孔在Orbit mini系统上也不需要。


一些我们在自制系统上的常用操作在Orbit mini上无法实行:
1. Cl-相关的限制: 因为Ag-AgCl电极內建在芯片内,溶液中的Cl-是无法排除的(只能保持脂双层两侧浓度相等)。也没办法用盐桥将电极与无Cl-溶液联通。因此,我们进行F-记录需要在两侧 200 mM NaF溶液中加入10 mM Cl-,这对我们的研究没有影响,因为我们已经研究了该通道对Cl-的不敏感性(在我们自制的设备上)。但是这可能对其他人研究阴离子选择性通道的特性有影响。
2. trans侧进行灌流 脂双层下的Trans侧无法灌流。所以与标准膜片钳一样,实验过程中只有一侧可以的溶液可以改变。这减少了脂双层系统相对于传统膜片钳的一个优势:记录通道时对离子通道两侧进行灌流。
3. 浓度梯度实验: 因为下侧小室极小的容积(只有~20 pL!!)以及溶液加入 Orbit mini的方式,两侧的小室开始假如的溶液是一样的,只能在脂双层形成后才可以施加 溶质梯度,并且智能改变上侧溶液,如果脂双层有破损,浓度差很容易就被抹平,那么必须重新替换调整个溶液并制备脂双层。



Miller教授使用Orbit mini获得平板脂双层上的氯离子通道单通道记录数据。

eLife. 2016;5:e18767. DOI:10.7554/eLife.18767